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6.抗辐射作用的检验方法

1. 亚急性试验
1.1　原理
　　一次性大剂量全身60Co-γ射线照射引起的急性辐射损伤主要表现为动物平均生存时间缩短、存活率下降、白细胞数目减少等。
　　1.2　丁器和试剂
　　血球计数板、显微镜、1%盐等。
　　1.3　实验方法
　　1.3.1　实验动物　18￣20 g昆明种小鼠，雄均可，每组20只。
　　1.3.2　剂量分组　设辐照对照组及3个剂量组，受试物剂量根据推荐的人体每公斤体重日摄入量，扩大10倍作为其中一个剂量。受试物于照射前后经口连续给予，每天一次，连续30 d。
　　1.3.3　实验步骤　受试物组于照射前后经口连续给予受试物，受试物组与辐射对照组均以同一剂量照射一次，照射剂量宜选择LD90左右（约7￣8 Gy）。照射后一半动物取血作白细胞计数，另一半动物观察平均存活时间或30 d存活率。
　　白细胞计数：在0.39 mL 1%盐中加入10 μL全血、计数计算池四个大方格中白细胞总数。
　　白细胞数(个/mm3)=四个大方格中白细胞总数×100
　　1.4　数据处理及结果判定
30 d存活率用卡方检验；白细胞计数及平均存活时间用方差分析。受试物组与辐射对照组比较，如果平均存活时间延长或30d存活率增高，以及白细胞总数增多，经统计学处理差异有显著性，则可判定该受试物对较高剂量一次性照射有拮抗作用。

2. 亚慢性试验或慢性试验
　　低剂量长期照射引起动物慢性辐射损伤主要敏感器官是骨髓和睾丸。
　　2.1　小鼠骨髓细胞微核试验
　　2.1.1　原理
　　可应用微核试验检测辐射对整体哺乳动物骨髓细胞染色体的损伤作用，如果在辐射同时给予受试物，即可研究该受试物染色体损伤的保护作用，即抗辐射作用。
　　2.1.2　丁器与试剂
　　解剖器械，生物显微镜，载玻片等。
　　小牛血清：小牛血清滤菌后放入56℃　温水浴保温1h进行灭活。通常储存于4℃冰箱冰盒里。亦可用大、小鼠血清代替。
　　Giemsa染液及应用液
　　1/5 mol/L磷盐缓冲液（pH6.8）
　　甲醇（分析纯）
　　阳性物：环磷　胺
　　2.1.3　实验方法
　　2.1.3.1　实验动物　昆明小鼠，7￣12周龄，体重25￣30 g，雄均可，每组10只。
　　2.1.3.2　剂量分组　设辐射对照组及3个剂量受试物组，根据推荐的人体摄入量，扩大10倍作为其中一个剂量。受试物经口给予，时间至少三个月。
　　2.1.3.3　实验步骤
　　照射剂量　累计剂量为半数致死剂量的1/2，连续照射每天一次，同时给予受试物，至少三个月。试验结束时，处死动物，取胸骨制片固定，染色，镜检。每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数，微核率以千分率表示。
　　2.1.4　数据处理及结果判定
　　一般采用泊松分布进行统计。受试物组微核率低于辐射对照组微核率，经统计处理差异有显著性，则可判定该受试物的该项抗辐射试验阳性。
　　2.2　小鼠睾丸染色体畸变试验
　　2.2.1　原理
　　可应用小鼠睾丸染色体畸变试验检测辐射对整体哺乳动物睾丸生殖细胞染色体的损伤作用，如果在辐射同时给予受试物，即可研究该受试物对染色体损伤的保护作用，即抗辐射作用。 2.2.2　丁器和试剂
　　实验室常用设备，离心机，生物显微镜。
　　1%柠檬三钠（分析纯）　取1 g柠檬三钠加蒸馏水至100 mL，宜新鲜配制。
　　60%冰乙（分析纯）　取60 mL冰乙加蒸馏水至100 mL，宜新鲜配制。
　　2.2.3　实验方法
　　2.2.3.1　实验动物　选用健康成年雄性昆明种小鼠，体重25￣30g，每组10只。
　　2.2.3.2　剂量分组　设辐照对照组及3个剂量受试物组，受试物剂量根据厂家推荐的人体每公斤体重日摄入量，扩大10倍作为其中一个剂量组。
　　2.2.3.3　实验步骤
　　照射剂量　累计剂量为半数致死剂量的1/2，连续照射每天一次，同时给予受试物至少三个月。动物处死前6 h腹腔注射秋水仙素4￣6 mg/kg BW。以颈椎脱臼法处死小鼠，取出两侧睾丸，去净脂肪，于低渗液中洗去毛和血污，放入盛有适量1%柠檬三钠或0.4%氯化钾溶液的小平皿中。以眼科小镊子撕开被膜，轻轻地分离开曲细精管，室温下低渗，低渗时间视具体条件而定（一般为20￣40 min为宜）。仔细吸尽低渗液，加固定液（甲醇：冰乙=3：1）10 mL，固定20 min。吸尽固定液，加60%冰乙1￣2 mL，待大部分曲细精管软化完后，立即加入倍量的固定液，打匀、移入离心管，以1 000 r/min离心10 min，弃去大部分上清液。留下约0.5￣1.0 mL，充分打匀制成细胞混悬液，将细胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上。每个样本制片2￣3张。空气干燥或微热烘干。用1：10 Giemsa液（pH6.8）染色20￣40 min。
　　畸变分析　参见GB 15193.8-94“食品安全性毒理学评价程序和方法”中的“小鼠睾丸染色体畸变试验”。
　　2.2.4　数据处理与结果判定
　　受试物组与致突变物对照组的断片、易位、畸变细胞率、常染色体单价体、性染色体单价体等分别按Kastenbaum和Bowman所述方法进行统计处理，若差异有显著性，则可判定该受试物的该项抗辐射试验阳性。